|
|
Genetics In the 3rd Millennium، جلد ۹، شماره ۲، صفحات ۲۳۸۶-۲۳۹۲
|
|
|
| عنوان فارسی |
بهینه سازی شرایط کشت باکتری متعهد BL۲۱ جهت تولید پروتئین نوترکیب PEP |
|
| چکیده فارسی مقاله |
پس از گذر از تحقیقات ژنومی و وجود انبوهی از اطلاعات در بانک های ژنومی اینک دوران تحقیقات در زمینه پساژنومی و شناخت محصولات ژنها، چگونگی ارتباطات آنها با یکدیگر و شناخت مسیرهای داخل سلولی با ابزار توانمند پروتئومیکس است. هدف از این بررسی بهینه سازی شرایط لازم جهت تولید پروتئین نوترکیب پراکسیزومی موشی (PEP) در سویه مناسب و مستعد شده از اشرشیاکلی به نام BL21 میباشد. پروتئین نوترکیب PEPدر مراحل بعد خالص شده و به عنوان بخشی از مطالعات پروتئومیکسی برای شناسایی اجزاء سلولی واکنش دهنده با آن به کار خواهد رفت. در این بررسی وکتور بیانی پروکاریوتی (pGEX6P2) که در آن cDNA PEP در مجاورت توالی کد کننده GST (گلوتاتیون ترانسفراز) قرار داده شده است، استفاده شد. سلول های باکتریایی سویه BL21 بوسیله این وکتور بیانی ترانسفورم شدند. برای به دست آوردن بالاترین میزان بیان و حلالیت پروتئین، کشت سلولهای باکتریایی در محدوده دمایی 37-20 سانتی گراد ارزیابی شد. همچنین غلظت مناسب IPTG برای القاء بیان با بررسی محدوده 1/0تا10 میلی مولار صورت گرفت. پس از به دست آوردن بالاترین میزان بیان در گام بعدی لازم است پروتئین های درون سلولی آزاد شوند، بنابراین با استفاده از امواج اولتراسوند با قدرت ها و در زمان های متفاوت سلول ها لیز و سپس با افزودن شوینده NP40 یا Triton X-100 در غلظت های مختلف، پروتئین های محلول باکتریایی و پروتئین نوترکیب بیان شده، آزاد شدند. بهینه ترین حالت برای بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب PEP در دمای °C20 و غلظت µg/ml0.1 از IPTG به دست آمد. همچنین تفاوتی در بکارگیری TritonX100 یا NP40 به عنوان شوینده های حلال غشایی به دست نیامد. هر چند که بهترین غلظت برای شوینده % 1 (حجمی/حجمی) مشخص شد. |
|
| کلیدواژه‌های فارسی مقاله |
|
|
| عنوان انگلیسی |
Optimizing the Cultural Condition of BL21 Competent Cells for Production of Recombinant Peroxisomal Protein |
|
| چکیده انگلیسی مقاله |
GST tagging is a valuable tool for quick detection, isolation, and analysis of protein-protein interactions, without prior knowledge of the target protein. The GST tag, as the most widely used tag with 27 kD weight, can be used for detection and/or purifying unknown interacting partners of bait protein. Previous studies have indicated that the peroxisomal protein (PEP), a recently characterized protein, is somehow involved in neural differentiation of embryonic stem cells. The aim of this study was efficient production and purification of the recombinant peroxisomal protein fused with the GST tag in bacterial competent Ecoli cells for further analysis to understand the special proteins which directly interact with PEP. Recombinant prokaryotic expression vector (pGEX6P2) encompassing Glutathione S-transferase (GST) cDNA fused with peroxisomal protein cDNA was transformed in BL21 Escherichia coli cells. E. coli cells, separately expressing GST and GST-PEP fusion protein were examined for efficient protein production. At first, various concentrations of isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) were added to the culture medium to optimize the induction condition. Next, cells were allowed to culture in different temperatures post induction. Finally, cells were ruptured in 600 µl of chilled Tris-HCl (pH: 7.5) containing 1 mM phenylmethylsulfonyl Fluoride (PMSF), in the presence of different concentrations of detergents (Triton X-100 or NP40), and sonicated. Sonication was done using different strengths of the ultrasonic probe. The lysate cells were centrifuged. The supernatant fraction was collected and incubated with 15 µl of 50% slurry glutathione-Sepharose at 4 °C for 3h. Glutathione-Sepharose beads were washed three times and resuspended in the same buffer for SDS-PAGE electrophoresis. Sepharose beads linked with glutathione were then used for binding and pull down of GST-PEP fusion protein. Fifteen µl of elution subjected to the gel and gel was stained with commasie brilliant blue (CBB) in order to detect the protein bands. The optimum gene expression was found when IPTG was added to the final concentration of 0.1 µg/ml bacterial cell culture overnight. We found no difference between Triton X-100 and NP40 usage as solublizing detergents. However, the best concentration for detergent was set to be 1% (V/V). |
|
| کلیدواژه‌های انگلیسی مقاله |
|
|
| نویسندگان مقاله |
لادن یاری | ladan yari
کامران قایدی | kamran ghaedi
پژوهشگاه رویان-پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی-مرکز تحقیقات علوم سلولی-گروه مهندسی ژنتیک-
سازمان اصلی تایید شده: پژوهشگاه رویان (Royan institute)
سمیه تنهایی | somayeh tanhaei
فرزانه ربیعی | farzaneh rabiee
محمد حسین نصر اصفهانی | mohammad hossien nasresfahani
مسعود هوشمند | massoud houshmand
رسول ذاکر | rasoul zaker
حسین بهاروند | hossein baharvand
|
|
| نشانی اینترنتی |
http://www.g3m.ir/browse.php?a_code=A-10-41-27&slc_lang=fa&sid=en |
| فایل مقاله |
فایلی برای مقاله ذخیره نشده است |
| کد مقاله (doi) |
|
| زبان مقاله منتشر شده |
fa |
| موضوعات مقاله منتشر شده |
عمومی |
| نوع مقاله منتشر شده |
Research |
|
|
|
برگشت به:
صفحه اول پایگاه |
نسخه مرتبط |
نشریه مرتبط |
فهرست نشریات
|