این سایت در حال حاضر پشتیبانی نمی شود و امکان دارد داده های نشریات بروز نباشند
مجله دانشکده پزشکی اصفهان، جلد ۳۹، شماره ۶۱۲، صفحات ۶۶-۷۵
عنوان فارسی ویرایش ژنی هدفمند در سلول‌های T پرایمری انسان با استفاده از ریبونوکلئوپروتئین‌های CRISPR/Cas۹
چکیده فارسی مقاله مقدمه: ناک اوت ژنی سلول‌های T پرایمری با واسطه‌ی Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) محدودیت‌های زیادی برای کاربردهای بالینی دارد. انتقال مستقیم پروتئین نوترکیب Cas9 و Guide RNA (gRNA) سنتتیک به عنوان یک کمپلکس ریبونوکلئوپروتئینی از پیش مونتاژ شده (Ribonucleoprotein یا RNP) به یک روش قدرتمند برای ویرایش ژنی بسیار کارآمد در سلول‌های T پرایمری تبدیل شده است. در این مطالعه، از سیستم انتقال مبتنی بر Cas9 RNP برای ناک‌اوت هدفمند ژن‌های T Cell receptor alpha constant (TRAC) و β2 microglobulin (B2M) در سلول‌های T پرایمری انسانی استفاده گردید. روش‌ها: بدین منظور gRNAهای اختصاصی برای هدف قرار دادن اگزون‌های ابتدایی ژن‌های TRAC و B2M طراحی شدند. پروتئین Cas9 و gRNAهای سنتتیک مربوطه به طور جداگانه ترکیب شدند و به سلول‌های T پرایمری انسانی جدا شده از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (Peripheral blood mononuclear cell یا PBMC) الکتروپوریت شدند. کارایی ویرایش ژنی با روش تجزیه و تحلیل Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) و فلوسایتومتری اندازه‌گیری شد. یافته‌ها: سه روز پس از الکتروپوریشن سلول‌های T پرایمری با استفاده از کمپلکس‌های RNP هدف‌گیری کننده‌ی TRAC و B2M، آنالیز TIDE کارایی ناک‌اوت 60-13 درصد را برای gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی TRAC و 53-21 درصد را برای gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی B2M مشخص کرد. آنالیز فلوسایتومتری نیز به ترتیب میزان 76 و 27 درصد سرکوب کامل بیان ژن را برای کارآمدترین gRNAهای هدف‌گیری کننده‌ی TRAC (TRAC-gRNA3) و (B2M-gRNA2) B2M تأیید کرد. نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه، نشان می‌دهد که سیستم Cas9 RNP می‌تواند به طور کارآمدی به سلول‌های T پرایمری منتقل و منجر به ناک‌اوت هدفمند ژن گردد. شیوه‌نامه‌ی شرح داده شده در این مطالعه، راهکار ساده و بسیار کارآمدی برای به حداکثر رساندن کارایی ویرایش در سلول‌های T پرایمری فراهم می‌سازد و روند ویرایش ژن برای ایمنوتراپی‌های نسل بعدی را تسهیل می‌کند.
کلیدواژه‌های فارسی مقاله ناک‌اوت ژن، ایمنوتراپی، گیرنده‌ی سلول T،
عنوان انگلیسی Targeted Gene Editing in Human Primary T Cells Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
چکیده انگلیسی مقاله Background: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9)-mediated gene knockout of primary T cell has several limitations for clinical applications. Direct delivery of recombinant Cas9 protein and synthetic gRNA, as a pre-assembled ribonucleoprotein (RNP) complex, has become a potent approach to introduce highly efficient gene editing in primary T cells. In this study, we employed Cas9 RNP-based delivery system for targeted T Cell receptor alpha constant (TRAC) and β2 microglobulin (B2M) genes knockout in human primary T cells. Methods: Specific gRNAs were designed to target the first exons of TRAC and B2M genes. Cas9 protein and respective synthetic gRNAs were then mixed separately, and electroporated into human primary T cells isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The gene editing efficiency was quantified using tracking of indels by decomposition (TIDE) analysis and flow cytometry. Findings: Three days after electroporation of primary T cells with the TRAC and B2M targeting RNP complexes, TIDE analysis revealed the knockout efficiency of 13-60 percent for the TRAC-targeting gRNAs and 21-53 percent for B2M-targeting gRNAs. Flow cytometry analysis confirmed ~76% and ~27% complete loss of expression for the most efficient gRNAs targeting TRAC (TRAC-gRNA3) and B2M (B2M-gRNA2), respectively. Conclusion: Our results demonstrate that Cas9 RNP system can be efficiently delivered into primary T cells and result in targeted gene knockout. The protocol described here enables a streamlined and highly efficient solution for maximizing editing efficiency in primary T cells, and simplifies the gene editing process for next-generation immunotherapies.
کلیدواژه‌های انگلیسی مقاله ناک‌اوت ژن, ایمنوتراپی, گیرنده‌ی سلول T
نویسندگان مقاله
نشانی اینترنتی https://jims.mui.ac.ir/article_12264_754f4f6e93dae4436a457dcbf105c64e.pdf
فایل مقاله فایلی برای مقاله ذخیره نشده است
کد مقاله (doi)
زبان مقاله منتشر شده fa
موضوعات مقاله منتشر شده
نوع مقاله منتشر شده
برگشت به: صفحه اول پایگاه   |   نسخه مرتبط   |   نشریه مرتبط   |   فهرست نشریات